时而嬉笑打闹，时而目瞪口呆，还记得此前诞生的世界首批体细胞克隆猴“中中”“华华”吗？这不，最近俩姐妹又新添了5位小伙伴——不同的是，这是5只BMAL1基因被敲除的克隆猴，具有重大科学意义

近日，《国家科学评论》在线发表了这一最新研究成果：中科院神经科学研究所“三剑客”（研究员孙强、刘真、张洪钧）经过两年努力，利用CRISPR/Cas9技术，成功构建了世界首批核心节律基因BMAL1敲除猕猴模型，仔细验证后发现，敲除猴模型存在昼夜节律紊乱，并表现出类似精神分裂的症状。

找到节律研究理想动物模型

雄鸡报晓，蜘蛛半夜结网，向日葵在清晨开放……

从简单的单细胞生物，到复杂的哺乳动物，自然界中大部分生物，都拥有按时间节奏调节自身活动的本领，即“生物节律”。

生物节律系统在维持机体内在的生理功能（如睡眠/觉醒系统、体温、代谢和器官功能等），适应环境的变化等方面扮演着重要角色。有关研究表明，生物节律紊乱与代谢综合征、自身免疫、神经退行性疾病和癌症等疾病密切相关。

然而，多数节律研究使用的小鼠等动物模型，与人的昼夜活动周期、脑结构和代谢速率等存在明显差异，由此造成的结果是：药物研发人员在小鼠模型上花费大量人力物力财力筛选到的候选药物，使用在病人身上大都无效，或有不可接受的副作用。这极大制约了生物节律紊乱机理研究和相关疾病治疗手段的研发。

在此背景下，与人类最接近的非人灵长类动物成为科学家们梦寐以求的实验对象。

“猕猴除了具有昼行性这一特性，在脑结构和功能上与人类高度相似，可以用来研究脑疾病和高级认知功能。”中国科学院院士、中国科学院神经科学研究所所长、脑智卓越中心主任蒲慕明说。

据世界卫生组织调查，过去十多年，全球各类疾病给社会造成的负担中，脑疾病占28%，已超过心血管疾病和肿瘤。

然而，时至今日，脑疾病的致病机理仍不清楚，尚缺乏特异的药物靶点。而且，相关神经性药物研发动辄需要十多年，耗资数十亿美元，失败率却大于90%。

为何？常用药物研发动物模型——小鼠，与人类相差甚远，是个重要原因。

“小鼠的遗传背景与人类相差较远，在此基础上研发的药物，百分之九十以上对人类没用。”蒲慕明解释。

向着科学的高峰努力奔跑，2018年，两只名为“中中”和“华华”的克隆猴诞生。从此，拔根汗毛吹口气就能变出一堆小猴子的神话变为了现实。

“按照传统方法，培养一批可用于药物研发的猴子需要花费五六年，体细胞克隆猴的实现，弥补了猕猴繁殖周期长、单胎数量少的不足，可以构建出足够数目的具有统一遗传背景的动物模型。”蒲慕明表示。

科学家们看来，“中中”“华华”两姐妹的横空出世，标志着非人灵长类克隆时代的到来。

批量制造基因编辑猴意义重大

“中中”“华华”的诞生，仅是万里长征走了第一步。

蒲慕明说，克隆猴的最大意义之一在于：可以由此批量制造经过基因编辑的猴子，从而为医疗界相关药物研发提供更优质的疾病模型。

不过，“中中”和“华华”都是野生猴子，使用的细胞来自于流产猴胚胎，从应用价值上来说，不如基因修饰的猴子那么大。

瞄准基因修饰猴，发起进攻。2015年底，神经所科研团队利用CRISPR/Cas9技术，敲除了生物节律核心基因BMAL1，产生了一批BMAL1缺失的猕猴。

结果如何？这些猴子有没有表现出预想的节律紊乱症状呢？

答案是肯定的。等到半年后小猴断奶，研究人员从多个方面开始观察敲除猴的生物节律。他们给猴子们佩戴了“小米手环”，以便随时监测它们的昼夜活动情况，发现敲除猴不再按照24小时的周期活动，在夜间活动明显增多。

这意味着什么？敲除猴出现了失眠的问题。此外，他们还有如下异常表现：比如，快速眼动睡眠（REM，浅睡期）和慢波睡眠（NREM，熟睡期）明显减少；帮助进入睡眠的褪黑素分泌较少；如果将敲除猴放入一个新环境中，它不能很快适应，不敢像正常猴那样在环境中自由探索……

这仅仅是偶然吗？研究人员又给猴子们做了一个经典的听觉刺激实验。

在给出的一连串规律的声音中随机插入特殊的声音，记录猴子听到声音时的脑电波，研究人员发现：敲除猴大脑在识别和反应这些特殊事件的能力上不如正常猴，这与精神分裂患者的情况类似。

而相关实验数据亦说明了同样的问题。比如，研究人员发现，与压力应激相关的皮质醇在敲除猴的血液中一直处于高水平。

“行为学分析表明，这些猕猴具有昼夜活动紊乱、睡眠障碍、焦虑和精神分裂等症状。”张洪钧告诉记者，血液分析也表明其与炎症、睡眠障碍、抑郁等相关的基因表达水平显著上调，这为模拟人的节律紊乱相关疾病迈出了关键一步。

如此大费周章构建基因敲除猴为哪般？其实，研究者最期望的就是在这些猴身上找到类似节律紊乱患者的症状，而这才是非人灵长类与小鼠等实验动物相比的真正优势。

先前的很多研究表明，节律紊乱或睡眠障碍还是一些精神疾病,例如，双向情感障碍、抑郁症、自闭症谱系障碍的早期症状。但是，很难认定一只小鼠有抑郁或是双向情感障碍之类的问题。

“从本次的研究可以看到，猴子表现出怕人、避免与人对视等症状，是以前在小鼠身上很难观察到的。”张洪钧说。

成功克隆基因敲除猴

敲除猴的异常表现，让张洪钧等人看到曙光。

如果克隆基因敲除猴，由此诞生的克隆猴，其表现是否一如既往？

像克隆“中中”“华华”那样，这一次，研究团队选中了睡眠紊乱最明显的BMAL1敲除猕猴的体细胞，通过体细胞克隆技术，获得了5只BMAL1基因敲除的克隆猴。

这是国际上首次成功构建一批遗传背景一致的生物节律紊乱猕猴模型。

听起来似乎很简单，不过是重复“中中”“华华”的克隆方法，没啥技术含量。其实不然。

根据刘真的说法，克隆的成功率与作为核供体的细胞有很大的关系。但细胞和人一样会在生长繁殖的过程中逐渐衰老，随着细胞不断分裂，其中会积累越来越多的DNA突变，细胞质量也会逐渐下降。

刘真介绍，“中中”“华华”所用到的胎猴体细胞，本身就来自小猴，十分年轻，自然活力强。但是，实际制作基因编辑猴所用的细胞比这要“年老”很多，更何况基因编辑本身还会对细胞的DNA造成一些损伤。

经过这么一番折腾后，克隆的成功率会跌到多少？刘真心里也没底。要知道，“中中”“华华”的克隆成功率较低。“克隆猴成本高昂，如果由此构建经过基因编辑后的克隆猴的成功率太低，很可能会因为成本问题而让这项技术长期停留在纸面上。”如果失败将会怎样，刘真不敢想象。

幸运的是，他们成功了。

经过两年努力，研究团队利用CRISPR/Cas9技术和克隆技术，成功构建了世界首批核心节律基因BMAL1敲除克隆猴模型。一次制备5只基因敲除的克隆猴，这在很大程度上打消了人们对克隆效率的担忧。

而从结果来看，本次实验的基因敲除非常成功。

“这项研究首次证实通过体细胞核移植技术可以克隆成年基因修饰猴。这为（在短期内）生产一批无嵌合体的基因修饰猴提供了一个完美的解决方案。”“这样的克隆猴（模型）对人类疾病研究有重要价值……”“这是一个新颖的模型，对疾病医疗手段研发极为有用……”“利用（体细胞）克隆技术获得遗传背景一致的猴模型将会加速对疾病发病机理及治疗靶点（筛查）的研究进程……”随着研究成果发表，国际同行的赞誉接踵而至。

在专家们看来，该成果表明中国正式开启了批量化、标准化创建疾病克隆猴模型的新时代，为脑认知功能研究、重大疾病早期诊断与干预、药物研发等提供新型高效的动物模型；该成果的应用有助于缩短药物研发周期，提高药物研发效率，必将极大地促进生命科学和医学的发展，加快中国新药创制与研发的进程。

“效率是应用的关键，因为研究项目时间较紧，这一次仅获得了5只BMAL1基因敲除的克隆猴。如何进一步提升效率，一次性‘复制’出更多只，这将是研究团队下一步攻关的重点。”蒲慕明表示。